Molecular heterogeneity of Malassezia pachydermatis through RAPDPCR / Heterogeneidade molecular da Malassezia pachydermatis através de RAPD-PCR

Several methodologies in molecular biology have been used in theinvestigation of Malassezia pachydermatis and its differentiation into subtypes. Recentmolecular research of this species includes the use of samples isolated from canine otitisexterna and dermatitis, as well as from healthy animals, having in view an epidemiologicalstudy of the yeast. The aim of this study was to identify molecular differences in M.pachydermatis samples isolated from dogs with otitis externa. The M. pachydermatis strainswere analyzed by means of the Random Amplification Primer DNA - Polimerase ChainReaction (RAPD–PCR) for molecular heterogeneity research. DNA extraction was carriedout with phenol-chloroform and the RAPD technique using the AGAATCCGCC primer.A variation was observed in the number and arrangement of the bands among the 49studied isolates, grouped into nine patterns. Isolate groupings were not found to be relatedto animal breed, age or sex. It was concluded that M. pachydermatis has differences in itsmolecular profile, as shown by the molecular technique (RAPD – PCR), which allowsisolates to be classified into nine subtypes.

Várias metodologias em biologia molecular têm sido aplicadas para estudar aM. pachydermatis diferenciando-a em subgrupos. Recentemente utiliza-se a investigaçãomolecular desta espécie isolada de otite externa e dermatite, e também de isolados da mesmade animais hígidos, para um estudo epidemiológico da levedura. O objetivo deste trabalhofoi identificar diferenças moleculares entre isolados de M. pachydermatis obtidos de casos deotite externa canina. Para isto, amostras da levedura provenientes de cães com estaenfermidade foram estudadas através da técnica de Polimorfismo de DNA Amplificado aoAcaso - Reação da Polimerase em Cadeia (RAPD–PCR) para pesquisa de heterogeneidademolecular. A extração de DNA foi realizada no processo fenol-cloroformio e a técnica deRAPD foi estudada com o primer AGAATCCGCC. Pode-se observar com estametodologia, variação no número e posição das bandas entre os 49 isolados estudados,podendo-se agrupá-los em nove padrões. Os agrupamentos formados pelos isolados nãoapresentaram relação com raça, idade ou sexo do animal. Concluindo-se que a M.pachydermatis apresenta diferenças em seu perfil molecular, observado pela técnica molecular(RAPD-PCR) que permite classificar os isolados desta espécie em até nove subtipos.

Ocorrência de Cryptococcus neoformans em excretas de pombos na cidade de Pelotas, Estado do Rio Grande do Sul / Occurrence of Cryptococcus neoformans in pigeon excrement in the city of Pelotas, State of Rio Grande do Sul

INTRODUÇÃO: O Cryptococcus neoformans é uma levedura capsulada, agente etiológico da criptococose em humanos e animais, encontrado em fontes ambientais, incluindo excretas de pombos, é uma importante causa de mortalidade em indivíduos imunodeprimidos em todo o mundo. MÉTODOS: Com o objetivo de verificar a ocorrência do Cryptococcus neoformans, em excretas de pombos, na Cidade de Pelotas, pesquisou-se 70 ambientes, incluindo prédios, praças e locais ao ar livre, da Cidade de Pelotas, RS. Após a coleta, os excrementos foram adicionados de salina com cloranfenicol, homogeneizados, semeados em ágar Sabouraud com cloranfenicol e ágar Níger e incubados a 32ºC. Para identificação, realizou-se exame direto, prova da fenoloxidase, urease, assimilação de carboidratos e cultura em meio CGB. RESULTADOS: Dos locais estudados (nº =70), em 26 (37,1 por cento) havia excretas de pombos. Estes lugares foram representados por prédios históricos (nº =8), torre de igreja (nº =1), engenhos e armazéns de arroz (nº =7), praça (nº =1) e locais ao ar livre (nº =9), o isolamento de Cryptococcus neoformans ocorreu em 26,9 por cento (nº =7/26), destes locais. CONCLUSÕES: O estudo chama a atenção, para o isolamento do fungo em áreas urbanas, que apresentavam grande acúmulo de excretas, indicando um risco para a saúde pública, especialmente para indivíduos imunocomprometidos.

INTRODUCTION: Cryptococcus neoformans is an encapsulated yeast and is the etiological agent for human and animal cryptococcosis. It is found in sources within the environment, including pigeon excrement, and is an important cause of mortality among immunocompromised individuals worldwide. METHODS: Seventy different environments in the city of Pelotas, Rio Grande do Sul, were surveyed for the purpose of investigating Cryptococcus neoformans occurrences in pigeon excreta. The environments included buildings, public squares and outdoor locations in the city. After collection, chloramphenicol saline solution was added to the excreta, which were then homogenized and seeded onto Sabouraud agar with chloramphenicol and onto Niger agar, and incubated at 32°C. Identification was performed by direct examination and by means of the phenoloxidase and urease tests, carbohydrate assimilation and culturing in CGB medium. RESULTS: Out of the sites investigated (n = 70), 26 (37.1 percent) of them contained pigeon excreta. These included historical buildings (n = 8), a church tower (n = 1), rice mills and warehouses (n = 7), a public square (n = 1) and outdoor locations (n = 9). Cryptococcus neoformans was isolated from 26.9 percent (n = 7/26) of these locations. CONCLUSIONS: This study draws attention to isolation of this fungus in urban areas that present large accumulations of pigeon excrement. This represents a risk to public health, especially for immunocompromised individuals.

Esporotricose cutânea experimental: Avaliação in vivo do itraconazol e terbinafina / Experimental cutaneous sporotrichosis: in vivo evaluation of itraconazole and terbinafine

O estudo objetivou avaliar a atividade in vivo do itraconazol e terbinafina no tratamento da esporotricose cutânea experimental. Foram utilizados 80 ratos Wistar divididos em quatro grupos (TERB20, TERB30, ITRA e CONT) inoculados no coxim plantar esquerdo com 0,2ml de solução contendo 2x103 células de Sporothrix schenckii/ml e tratados com terbinafina (20 e 30mg/kg), itraconazol (10mg/kg) e placebo durante 13 semanas. As lesões do sítio de inoculação foram avaliadas e mensuradas semanalmente, assim como a disseminação das mesmas. Após foi realizada análise micológica e histopatológica. Os resultados demonstraram que os animais do grupo ITRA diferiram estatisticamente em todos os parâmetros avaliados em relação ao CONT. Em relação à terbinafina, não houve diferenças estatísticas entre os grupos tratados e controle. Pode-se confirmar a boa atividade do itraconazol no tratamento da esporotricose e a pouca eficácia da terbinafina nas doses utilizadas, sendo necessários mais estudos com este antifúngico.

The aim of this study was to evaluate the in vivo activity of itraconazole and terbinafine for treating experimental cutaneous sporotrichosis. Eighty Wistar rats were used, divided into four groups (TERB20, TERB30, ITRA and CONT). They were inoculated in the left plantar pad with 0.2 ml of solution containing 2x10³ cell/ml of Sporothrix schenckii and treated with terbinafine (20 and 30 mg/kg), itraconazole (10 mg/kg) or placebo for 13 weeks. The lesions at the inoculation site were evaluated and measured weekly, along with their dissemination. Mycological and histopathological analyses were performed subsequently. The results showed that the animals in the ITRA group differed statistically in all parameters evaluated, in relation to CONT. For terbinafine, there were no statistical differences between the treated and control groups. It could be confirmed that itraconazole presented good activity for treating sporotrichosis, while terbinafine was ineffective for this disease at the doses used. However, more studies on the latter antifungal agent are needed.

CLSI broth microdilution method for testing susceptibility of Malasseziapachydermatis to thiabendazole / CLSI método de Microdiluição em Caldo para teste de suscetibilidade da Malassezia pachydermatis frente ao tiabendazol

Thiabendazole, classified as antiparasitic and also used as an antifungal drug, can be found as otological solution indicated for treatment of parasitic and fungal external otitis in small animals. Malassezia pachydermatis is a yeast recognized as a normal inhabitant on the skin and mucous membranes of dogs andcats. However, it is considered an opportunistic agent that causes external otitis and dermatitis in these animals. The aim of this study was to evaluate the in vitro effect of thiabendazole against 51 isolates of M. pachydermatis using the CLSI Broth Microdilution method that has been adapted for this yeast species (NCCLS, 2002). Based on this test, the Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) of thiabendazol was calculated. Subsequently, the susceptibility of each isolate against this antifungal was determined. It wasobserved that the MIC of thiabendazole against M. pachydermatis ranged from 0.03 to > 4 μg/mL. A total of 13.7% of the isolates were found to be resistant, 47.1% were intermediate and 39.2% were sensitive to the drug. The rate of resistance of the yeasts against thiabendazole was similar to the results previously obtained with other antifungals, while the adapted broth microdilution technique used in this study proved to be efficient.

Tiabendazol, um fármaco classificado como antiparasitário e também usado como antifúngico, pode ser encontrado como solução otologica indicada no tratamento da otite externa parasitária e fungica em pequenos animais. Malassezia pachydermatis é uma levedura considerada habitante normalda pele e das mucosas de cães e gatos. Entretanto, considerase um agente do oportunista causador de otite externa edermatite nestes animais. A finalidade deste estudo foi avaliar o efeito in vitro do tiabendazol frente a 51 amostras de M. pachydermatis através do método CLSI de Microdiluição em Caldo adaptado para esta espécie de levedura (NCCLS, 2002). Baseado neste teste calculou-se as Concentrações InibitóriasMínimas (CIM) do tiabendazol e, subseqüentemente, foi detectada a suscetibilidade de cada amostra frente a este antifungico. Observou-se que a CIM do tiabendazol frente a M. pachydermatis variou de 0,03 a > 4 μg/mL. Estas amostras foram classificadas em resistente (13,7%), sensibilidade intermediária (47,1%) e sensível (39,2%). A resistência dalevedura frente ao tiabendazol mostrou similaridade com resultados anteriormente observados com outros antifúngicos e a adaptação da técnica de Microdiluição em Caldo utilizada mostrou-se eficiente.

Comparison of the broth microdilution technique and ETEST to ketoconazole front Malassezia Pachydermatis / Comparação da técnica de microdiluição em caldo e ETEST para o cetoconazol frente à Malassezia pachydermatis

Malassezia pachydermatis is recognized as a normal inhabitant and an opportunistic pathogen of the external ear canal and skin of dogs and cats. In special clinical conditions, and mainly in the cases of therapeutic failure related to external otitis and dermatitis complicated by this yeast, is recommended testing susceptibility to antifungal drugs. Different approaches of evaluating the susceptibility of yeasts faced to antifungals in laboratory exist, some of them are commercial approaches and others previously standardized by the CLSI (NCCLS,2002). The purpose of this study was to evaluate the susceptibility of 17 samples of M. pachydermatis from canine external otitis using two different in vitro antifungal susceptibility methods: the Etest®and the broth Microdilution Method (MD) with ketoconazole. The mean MIC observed between the 17 samples were 0.103mg/mL to ETEST and 0.0012mg/mL to MD ranging from 0.004 to 0.75mg/mL in ETEST and 0.0019 and 0.03mg/mL in MD using the same samples. By ETEST, two (11.8%) samples were resistant, eight(47.1%) susceptible and seven (41.1%) showed intermediate susceptibility. Through the MD it was observed four (23.5%) resistant samples, seven (41.2%) susceptible and six (35.3%) samples with intermediate susceptibility. Despite of the percentages being equivalent in each rank of susceptibility through the two techniques, the results do not correspond to the same sample. These results showed that there is an urgent need to standardize those values considered as parameters for growth inhibition of this yeast. Then a simple and efficient method could be used routinely in the laboratory practice.

Malassezia pachydermatis é reconhecida como um habitante normal e patógeno oportunista do meato acústico externo e da pele de cães e gatos. Em condições clínicas especiais e em casos de falha terapêutica relatada em otite externa e dermatite complicada por esta levedura, é recomendado o teste de suscetibilidade antifúngica. Existem diferentes métodos de avaliação da suscetibilidade da levedura frente a antifúngicos em laboratório, alguns métodos comerciais e outros previamente padronizados pelo CLSI (NCCLS, 2002). O objetivo deste estudo foi o de avaliar a suscetibilidade de 17 amostras de M.pachydermatis proveniente de otite externa canina por meio de duas técnicas in vitro de antifungigramas: o Etest® e a microdiluição em caldo (MC) com o cetoconazol. A media da Concentração Inibitória Mínima (CIM) observada entre as 17 amostras foram 0.103mg/mL para o ETEST e 0.0012mg/mL para a MC variando de 0.004 a0.75mg/mL no ETEST e entre 0.0019 e 0.03mg/mL na MC usando as mesmas amostras. Pelo ETEST, duas (11.8%) amostras foram resistentes, oito (47.1%) sensíveis e sete (41.1%) mostraram sensibilidade intermediária. Na MC foram observadas quatro (23.5%)amostras resistentes, sete (41.2%) sensíveis e seis (35.3%) amostras com sensibilidade intermediária. Apesar das porcentagens de sensibilidade serem semelhantes pelas duas técnicas, os resultados de CIM não correspondem na uma mesma amostra. Estes resultados mostraram que há uma urgente necessidade de padronização dos valores considerados como parâmetros para inibição do crescimento da levedura. Portanto, um método simples e eficiente deveria ser usado rotina na prática de laboratório.

Efficacy of terbinafine and itraconazole on a experimental model of systemic sporotrichosis / Eficiência de terbinafina e itraconazol em um modelo experimental de esporotricose sistêmica

Itraconazole is currently considered the drug of choice to treat the diverse clinical presentation of sporotrichosis. On the other hand terbinafine by virtue of its excellent in vitro activity is under comparative evaluation for its therapeutic potential for a wide range of fungal infections. In this study, our aim was to determine the in vivo efficacy of terbinafine and itraconazole on a experimental model of systemic sporotrichosis. 120 rats Wistar received an injection of 2x10³ S. schenckii cells by via the lateral tail vein. After 3 days the animals were treated with terbinafine (250mg/kg) and itraconazole (100 mg/kg) and their respective diluents. In our model, terbinafine and itraconazole were effective in reducing the number of clinical lesions and positive organ cultures. There was statistical difference between the groups treated with the antifungals in relation to the control groups (p<0,05) concerning the clinical alterations, anatomic-pathological findings and in the positive organ cultures of the agent, being that the treated animals resulted in the absence and/or reduction of all the evaluated parameters. As for the treatments, terbinafine showed similar or higher activity that itraconazole in the evaluation of the testicle alteration (p=0,0004), as well as in the positive organ cultures of microorganism from the organ (p=0,0142). With these results it is possible to conclude that the antifungals studied are effective in the treatment of experimental systemic sporotrichosis.

Itraconazol é atualmente considerado a droga de escolha para o tratamento das diferentes formas clínicas da esporotricose. Por outro lado a terbinafina devido a sua excelente atividade in vitro está sendo avaliada quanto ao seu potencial terapêutico frente a diversas infecções fúngicas. O objetivo deste estudo foi determinar a eficácia in vivo da terbinafina e itraconazol em um modelo de esporotricose experimental sistêmica. 120 ratos Wistar receberam uma injeção de 2x10³ células de S. schenckii pela veia lateral da cauda. Após 3 dias os animais foram tratados com terbinafina (250mg/kg) e itraconazol (100mg/kg) e os seus respectivos diluentes. No modelo experimental estudado, a terbinafina e itraconazol se mostraram efetivos reduzindo o número de sintomas clínicos e retroisolamento positivo para o agente. Houve diferenças estatísticas entre os grupos tratados com os antifúngicos em relação aos grupos controle (p<0,05) nas alterações clínicas, achados anatomopatológicos e no retroisolamento do agente, sendo que os animais tratados resultaram na ausência e/ou diminuição de todos os parâmetros avaliados. Quanto aos tratamentos a terbinafina se mostrou com atividade similar ou superior ao itraconazol quando avaliado as alterações anatomopatológicos do testículo (p=0,0004), assim como no retoisolamento do órgão (p=0,0142). Com estes resultados permite-se concluir que os antifúngicos estudados são efetivos no tratamento da esporotricose sistêmica experimental.

Efeitos de doses elevadas da terbinafina e itraconazol em ratos Wistar / Effects of high doses of terbinafine and itraconazole in Wistar rats

Levando em consideração a importância do itraconazol e da terbinafina na terapia antifúngica, o estudo tem como objetivo avaliar os efeitos de altas doses de itraconazol (100 mg/kg) e terbinafina (250 mg/kg) em ratos albinos wistar através das análises das enzimas hepáticas (ALT e ALP), hemograma completo e estudo histopatológico de diferentes órgãos. Os fármacos foram administrados pela via oral, uma vez ao dia, por um período de 30 dias, quando foi coletado sangue e realizado a necrópsia dos animais experimentais. Os valores detectados das enzimas hepáticas e do hemograma foram compatíveis aos índices fisiológicos para a espécie estudada não sendo observadas diferenças estatísticas entre os grupos experimentais. A histopatologia não revelou nenhuma anormalidade, porém 25 por cento dos animas tratados com terbinafina morreram imediatamente após a administração do fármaco. Com esses resultados concluiu-se que as doses administradas dos fármacos não alteraram as enzimas hepáticas avaliadas, assim como o hemograma, sendo, no entanto, necessários mais estudos que possibilitem considerar doses elevadas da terbinafina e itraconazol como alternativa terapêutica viável para o tratamento de micoses sistêmicas.

Taking into account the importance of the itraconazole and terbinafine in the antifungal therapy, the study has as objective evaluate the effects of high itraconazole doses (100 mg/kg) and terbinafine (250 mg/kg) in rats albino Wistar through the analyses of the hepatic enzymes (ALT and ALP), complete blood count and histopathologic study of different organs. The drugs were administered orally once a day, for a period of 30 days, when blood was collected and accomplished the necropsy of the experimental animals. The detected values of the hepatic enzymes and of the blood count were compatible to the physiologic indexes for the studied species with no statistical differences among the experimental groups. The histopathologic exam did not reveal any abnormality, however 25 percent of the treated with terbinafine died immediately after the administration of the drug. With those results we concluded that the administered doses of the drugs did not alter the appraised hepatic enzymes, as well as the blood count. However, more studies are needed to consider high doses of the terbinafine and itraconazole as viable treatment alternative for systemic mycosis.

Suscetibilidade in vitro de isolados de Sporothrix schenckii frente à terbinafina e itraconazol / In vitro susceptibility of isolates of Sporothrix schenckii to terbinafine and itraconazole

O estudo objetiva determinar a atividade in vitro da terbinafina e itraconazol através da técnica de microdiluição em caldo (NCCLSM27-A2) adaptado para um fungo dimórfico frente a 12 isolados de Sporothrix schenckii, sendo seis de esporotricose felina, três de esporotricose humana, um isolado de cão e dois isolados humanos provenientes do Instituto Oswaldo Cruz (IOC). O inóculo e as concentrações antifúngicas foram distribuídas em microplacas, as quais foram incubadas a 35°C por cinco dias, quando foi realizada a leitura da concentração inibitória mínima. A concentração inibitória mínima para a terbinafina variou de 0,055µg/ml a 0,109µg/ml e para o itraconazol de 0,219µg/ml a 1,75µg/ml, sendo que para ambos os fármacos as CIMs entre os isolados do IOC foi de 0,875µg/ml. O estudo demonstrou uma alta suscetibilidade do Sporothrix schenckii frente à terbinafina, necessitando mais estudos que correlacionem os testes in vitro frente ao fármaco com a resposta clínica em pacientes com esporotricose.

The study objective was to determine the in vitro activity of terbinafine and itraconazole through the microdilution technique in broth (NCCLSM27-A2), adapted for dimorphic fungus, in relation to 12 isolates of Sporothrix schenckii. Six were from feline sporotrichosis, three from human sporotrichosis, one from a dog and two from human isolates originating from Instituto Oswaldo Cruz. The inoculum and antifungal concentrates were distributed on microplates that were incubated at 35°C for five days. Minimum inhibitory concentration readings were made at the end of this period. The MIC for terbinafine ranged from 0.055µg/ml to 0.109µg/ml, and the MIC for itraconazole ranged from 0.219µg/ml to 1.75µg/ml. For both drugs, the MIC from the isolates from IOC was 0.875µg/ml. The present study demonstrates the high susceptibility of Sporothrix schenckii to terbinafine. Further studies to correlate the in vitro susceptibility tests with the clinical response of patients with sporotrichosis are needed.

Isolation of Sporothrix schenkii from the nails of healthy cats

Many cases of sporotrichosis in cats were diagnosed in the town of Rio Grande, RS, Brazil, caused mainly by inoculation due to scratches. In this work, we evaluated the frequency of Sporothrix schenckii in the nails of healthy cats living together with cats showing clinical sporotrichosis. The isolation of the fungus was carried out pressing unwashed nails of the forelimbs of 24 cats (48 paws) directly onto the surface of Mycobiotic Agar in Petri dishes. S. schenckii was isolated from seven (29.1 percent) cats. The procedure for isolation of the fungus was simpler than methods that require sedation and cuts of the nails.

Um número elevado de casos de esporotricose em gatos foi diagnosticado na cidade de Rio Grande/RS/Brasil, e na maioria dos animais, a doença ocorreu após inoculação do fungo a partir de arranhões. Nesse estudo, avaliou-se a freqüência de Sporothrix schenckii nas unhas de gatos saudáveis que conviviam com gatos com esporotricose. O isolamento do fungo foi realizado a partir da impressão das unhas dos membros torácico direito e esquerdo, de 24 gatos (48 patas), diretamente em placas de Petri com Agar Mycobiotic sem lavagem prévia das unhas. S. schenckii foi isolado de sete gatos (29,1 por cento). O procedimento adotado para o isolamento do fungo foi mais simples que os procedimentos que requerem sedação e corte das unhas do animal.

Isolation of Candida spp from vaginal microbiota of healthy canine females during estrous cycle

As leveduras são organismos comensais da pele, trato genital e gastrointestinal, e de outras mucosas de mamíferos. O gênero Candida vem sendo isolado freqüentemente de animais domésticos e silvestres. O isolamento de Candida spp da mucosa vaginal de mulheres é freqüente, porém na espécie canina são escassos os estudos referentes à microbiota fúngica vaginal, especialmente do gênero candida, não se tendo conhecimento de sua relacão com o ciclo reprodutivo. O presente trabalho teve como objetivo isolar leveduras do gênero Candida em fêmeas caninas hígidas e identificar as espécies isoladas, relacionando-as com as diferentes fases do ciclo estral. Foram analisadas 224 amostras obtidas da mucosa vaginal de 14 fêmeas caninas. Candida spp foi observada em 83 (37 per center) amostras, destas, nove (42,9per center) foram obtidas no proestro, 14 (43,8 per center) no estro, 31 (62 per center) no diestro, 24 (21,1 per center) no anestro e cinco (71,4 per center) de gestantes. Nas amostras caracterizadas, C. parapsilosis foi a espécie isolada com maior freqüência (21,7 per center), seguida de C. guillermondii (8,4 per center), C. kefir (6 per center) e C. albicans (4,8 per center). Com base neste estudo pode-se concluir que Candida spp faz parte da microbiota vaginal de fêmeas caninas hígidas, e que o isolamento é influenciado pelo ciclo reprodutivo.